曹玉洁,
张玲红,
苗昱辰,
卢里,
李春草,
张璐,
胡瑞,
李江艳,
夏惠,
陶志勇,
方强
目的基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息, 设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂, 将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接, 构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体, 尾静脉注射感染小鼠, 24 h后采血查获疟原虫后, 给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫, 喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定, 最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠, 8 d后采血镜检疟原虫, PCR鉴定, 筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内, 每只接种1×105感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片, 经吉姆萨染色后镜检计算原虫率, 记录数据进行统计学分析。结果PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列, 与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d, 用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失, 用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带, 片段长度1 246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序, 测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上, 通过有限稀释感染12只小鼠, 经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带, 检测不到野生型疟原虫的残留, 获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症, 且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天, 2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株, 为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。
